FlowJo是一款專業(yè)的流式細胞分析專業(yè)軟件，F(xiàn)lowJo能兼容幾乎所有流式儀器采集的數(shù)據(jù)，通過圖像分析細胞的各種變化。FlowJo簡單易用，功能強大，真實的模擬數(shù)據(jù)支持，采用色彩豐富的二維圖進行系統(tǒng)分析，幫助用戶輕松了解了解細胞的狀態(tài)變化擁有流動室和液流驅(qū)動系統(tǒng)，光電轉(zhuǎn)換器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等先進的科學(xué)技術(shù)。

FlowJo功能

1.單標樣本

單標記樣本數(shù)據(jù)常用的顯示方式是單參數(shù)直方圖。通常橫坐標可以是線性標度或?qū)?shù)標度，代表著所檢測的熒光或散射光的強度；縱坐標表示的是橫坐標某一特定熒光強度的細胞數(shù)，有時也用相對百分比來表現(xiàn)。

以3 color comp 文件夾中的CyPE comp.fcs進行分析演示。將此文件夾移至桌面，并把該數(shù)據(jù)文件夾從桌面拖入Flowjo中的組空間中。

在組空間中單擊選中“3 color comp”組，此時在樣本空間里顯示“3 color comp”組中的所有樣本。而后在樣本空間中雙擊“Cy5PE comp.fcs”，出現(xiàn)圖形窗口。

此為二維點圖，X軸選擇SSC（側(cè)向散射，細胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，質(zhì)量越大，SSC越大，反之越小。）Y軸選擇FSC（前向散射，細胞越大，F(xiàn)SC越大；反之越小。）

選擇設(shè)門工具（矩形門、橢圓門、多邊形門、自動門）中的任意一個，在二維點圖中選中淋巴細胞。

在圖形窗口中雙擊選中的淋巴細胞，生成新的圖形窗口。在X軸選擇Cy5PE:CD4，Y軸選擇Histogram，選擇設(shè)門工具（區(qū)域門、雙分門）中任意一個，在單參數(shù)直方圖中設(shè)門。

2.多色標樣本

多色標記樣本，包含雙標記、三標記及以上的樣本。橫坐標和縱坐標分別代表與細胞有關(guān)的兩個獨立參數(shù)，平面上的每一個點表示具有相應(yīng)坐標值的細胞。

以三標記樣本為例，選擇3-color-experiment文件夾中的931115-B02-Sample01.FCS進行分析演示。同樣，在在樣本空間中雙擊“931115-B02-Sample01.FCS”樣本，出現(xiàn)圖形窗口，顯示為二維點圖。X軸選擇FSC，Y軸選擇SSC。然后選擇多邊形設(shè)門工具，在二維點圖中選中淋巴細胞。

雙擊淋巴細胞門，出現(xiàn)圖形窗口，X軸選擇Fluor::CD3，Y軸選擇FSC。使用矩形設(shè)門工具選中CD3陽性細胞，設(shè)門并命名為T細胞。

雙擊T細胞門，出現(xiàn)圖形窗口，在X軸選擇Cy5PE::CD4，Y軸選擇PhyEry::CD8，使用十字門工具設(shè)門（拖動鼠標將四分門移到目標位置即可，一般根據(jù)細胞分群的趨勢，四分門的界定線可設(shè)在陰性、陽性細胞的分群處），如下圖所示：

Q1：CD8單陽性細胞，為CD8+ T細胞

Q2：雙陽性細胞

Q3：CD4單陽性細胞，為CD4+ T細胞

Q4：雙陰性細胞

3.細胞凋亡（Cell apoptosis）

拖入凋亡樣本，雙擊原始數(shù)據(jù)打開圖形窗口。X軸選擇FSC-A，Y軸選擇SSC-A。分析凋亡的細胞選擇上圖所示的細胞群體進行分析。細胞碎片不予分析。

在SSC/FSC圖中雙擊“分析的細胞群體”，X軸選擇FITC,用來表示AnnexinV-FITC。Y軸選擇PE-Texas,用來表示PI。用四分門設(shè)門工具界定活細胞和凋亡細胞。如下圖所示：

Q1：(AnnexinV-FITC)-/PI+，此區(qū)域的細胞為壞死細胞。也可能有少數(shù)的晚期凋亡細胞在其中，甚至機械損傷的細胞也包含其中。

Q2: (AnnexinV+FITC)+/PI+，此區(qū)域的細胞為晚期凋亡細胞。

Q3：(AnnexinV-FITC)+/PI-，此區(qū)域的細胞為早期凋亡細胞。

Q4：(AnnexinV-FITC)-/PI-，此區(qū)域的細胞為活細胞。

通常統(tǒng)計細胞凋亡率時采用Q2+Q3，晚期凋亡＋早期凋亡群（即所有AnnexinV陽性群）。

4.細胞周期（Cell Cycle）

細胞周期的檢測是流式細胞儀最為廣泛的應(yīng)用之一。細胞周期是指以有絲分裂方式增殖的細胞從親代分裂結(jié)束到子細胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程。通常由G1期、S期、G2期和M期組成。細胞在G1期完成必要的生長和物質(zhì)準備，在S期完成染色體DNA的復(fù)制，在G2期進行必要的檢查和修復(fù)，以保證DNA復(fù)制的準確性。在M期完成遺傳到子細胞中的均等分配，使細胞進行分裂。

細胞周期檢測中PI最為常用。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細胞儀進行分析，就可以得到細胞周期各個階段的DNA分布狀態(tài)，從而計算出各個期的百分含量。

以cell cycle 文件夾中的5206.001，PI標記為例，設(shè)門選取目標細胞群體，將細胞碎片排除在外。即雙擊工作臺中的5206.001樣本，打開圖形窗口。X軸選擇FSC-H，Y軸選擇SSC-H，細胞碎片位于左下角的位置，設(shè)門選中目標細胞，如下圖：

設(shè)門選中要進行細胞周期分析的單細胞群體，排除粘連細胞（粘連在一起的雙細胞或多細胞團塊等）的影響。X軸選擇FL2-W(width)，Y軸選擇FL2-A(area)，設(shè)門方式如下圖：

BD的流式儀采集的數(shù)據(jù)：在進行周期分析的時候，通常是采用FL2-A與FL2-W（或者FL2-A與FL2H）進行設(shè)門。

Beckman的流式儀采集的數(shù)據(jù)：X軸選擇FL3-LIN,用來表示PI的線性信號。Y軸選擇FL3-PEAK,用來表示PI的峰值信號。設(shè)門方式如下圖：

在FlowJo工作臺中選中“單細胞群體”這個節(jié)點，在菜單欄的“工具”中選擇“細胞周期”，打開周期分析窗口。得到G1期、S期、G2期細胞百分比，G1期CV值和G2期CV值等數(shù)據(jù)。

圖中粉色的曲線是周期擬合的模型曲線，黑色的為樣本曲線。理想狀況是粉色和黑色曲線吻合一致為最佳。擬合的好壞可以根據(jù)右邊的RMS值來判斷。RMS(root mean square error)值越小越好，當周期擬合的不好的時候，可以通過更換擬合模型（Watson和Dean-Jett-Fox）或者更改限制條件確保（G1是G2的兩倍）進行調(diào)整。

而G1/S/G2百分比：G1/S/G2期細胞所占的百分比。G1/G2均數(shù)：G1/G2期細胞熒光強度的平均數(shù)。CV（Coefficient of Variation，變異系數(shù)）：儀器因素和樣品制備及染色過程對標本的人為影響。通常G0/G1峰的CV來檢測分辨率或精度。G1 cv/G2 cv：G1/G2峰的變異系數(shù)，其大小反映了G1/G2峰的寬度，數(shù)值越小，峰越窄。

FlowJo 處理流式數(shù)據(jù)簡單易學(xué)，而且TOP10 免疫學(xué)期刊上的文章大多數(shù)都是用 FlowJo 分析數(shù)據(jù)。使用好FlowJo對發(fā)高分文章會有很大的幫助。

安裝方法

首先安裝主程序 ，安裝完成后先不要打開。插上U盤，運行注冊機，自動識別到U盤，點擊下方【Generate license above device!】會自動在U盤中生成一個 license.key 文件。

運行軟件，選擇【Use a hardware-based license (dongle)】后點擊【Done】按鈕即可。



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